南京博物院是我国最早创建的博物馆之一。南京博物院之前身是1933年由我国近代民主革命家、教育家，时任国立中央研究院院长的蔡元培先生倡议创建的国立中央博物院筹备处。蔡先生亲自兼任 第一届理事会理事长，在中山门半山园征地12.9公顷，原拟建“人文”、“工艺”、“自然”三大馆，后因时局关系，仅建“人文馆”，即现在的南京博物院大殿。当时通过收购、拨交、发掘，集中全国第一流珍品约二、三十万件，其中包括绘画中的《历代帝后像》、《唐明皇幸蜀图》；铜器中的《毛公鼎》、《司母戊鼎》等稀世国宝。一批著名专家云集于此，如李济、吴金鼎、夏鼐、曾昭橘、王天木等。在抗日战争内迁西南期间，进行考古发掘、民族调查，并出版有《云南苍洱境考古报告》、《么些象形文字字典》、《博物馆》等许多专著。北平历史博物馆曾一度归属于中央博物院的建制而成为分院。当时为全国唯一一座仿照欧美第一流博物馆建馆的现代综合性大型博物馆，直属当时的教育部领导。
1949年新中国成主后，南京博物院进入一个新的历史阶段，仍称“国立中央博物院”，直接由中央文化部领导， 1950年3月9日经文化部批准正式改为“国立南京博物院”，性质仍是全国综合性历史艺术博物馆，由文化部文物事业管理局领导，经费由中央拨款，任务由文化部直接布置，如南唐二陵发掘，六朝陵墓调查等。
1950年7月改由华东文化部领导，属华东大区博物馆，包括东南地区五省一市（江苏、安徽、浙江、福建、台湾、上海），还建立华东文物工作队，队部设在南京博物院，这期间发掘了山东沂南汉画像墓、安徽寿县春秋时代蔡侯墓、浙江杭州老和山新石器时代遗址、福建闽侯昙石山新石器时代遗址，还奉命派人到郑州协助发掘商代遗址。
1954年9月华东大区撤消后，南京博物院改由江苏省政府文化局领导，属全国综合性历史艺术博物馆，是全国重点博物馆之一。
这里需要特别指出的是，建国50年来，在各级党和政府的领导下，经过全体职工共同努力，尤其是党的十一届三中全会后，成绩更为突出。首先把原中央博物院留下的建筑未了工程，修缮而装饰一新，屋顶铺盖金黄色琉璃瓦，添砌仿汉阙大门，修筑庭前马路，绿化周围环境，兴建大殿前的月台。门前面向通往东郊明孝陵和中山陵的林荫大道，沪宁高速公路经门口穿过而进入市内繁华地区；门内庭园广阔，花木葱葱似锦，衬托出仿辽式宫殿建筑的陈列大殿的端严和壮观。
除原有中山门、朝天宫两处藏品库房外，近年又在大殿右侧新建一座3000平方米现代化的新库房，使文物保管条件得到很大改善。大殿底层的新展厅，即30年代原图纸上设计的连接二楼陈列大厅的底层陈列厅，计2400平方米，也已建成，目前连同二楼2390平方米陈列大厅，举办有《长江下游五千年文明展》、《我们的昨天——祖国的历史、民族和文化展》、《江苏考古陈列》三个基本陈列，常年对观众开放。大殿前方西侧的一座与现大殿相似的仿古宫殿式艺术陈列馆，即30年代原计划兴建中的工艺馆，计12600平方米。内设珍宝馆、青铜馆、瓷器馆。书画馆、玉器馆、织绣馆、陶艺馆、漆艺馆、民俗馆、现代艺术馆、名人书画馆等11个专题陈列展馆。
藏品征集工作也有长足发展，目前有各类藏品42万件，国宝级文物和国家一级文物有二千件以上，其中考古发掘品、少数民族文物、外国文物、宫廷器皿、清代文书以及日寇投降仪式的文物，都是全国独有的罕见品，科学价值较高。院藏中外专业图书近30万册，其中还有全国少有的善本书和殿版书。历年新征集的古代书画，总数亦在3万件以上，其中包括宋、元时代的珍品，不论在数量上或质量上，都是名列全国前茅的精品。建国后新出上的东海大贤庄旧石器，邱县大墩子彩陶器，仪征、丹徒、六合等地出土的西周和春秋时代青铜器，盱眙出上的战国金兽，徐州和扬州东汉诸侯王墓出上的银缕王衣及“广陵王玺”金印，南京、丹阳一带六朝时代的青瓷器和“竹林七贤及荣启期”砖刻壁画，以及南京祖堂山南唐二陵的陶舞诵，都是备受国内外学术界瞩目的珍品。近年主持或参加的考古工作，如昆山赵陵、高邮龙虬庄、扬州唐城、徐州狮子山西汉楚王陵以及苏州真山吴楚贵族墓地，“八五”期间，相继被评为全国十大考古发现及获得荣誉奖。与日本学术单位合作的“佛教南传”、“早期水稻田遗址考古”、“江南人骨研究”都取得了备受国内外瞩目的成绩。
陈列展览在办好基本陈列的同时，还举办各种专题展览，总数约300个左右，观众达1200万，其中海外观众50余万，影响几乎遍及世界五大洲。特别是近几年随着对外开放，进行国际间文化交流，曾先后在日本、德国、埃及、墨西哥、苏联、比利时、韩国、澳大利亚等国家和香港、澳门、台湾地区举办展览，为弘扬民族文化做出了最大努力和积极贡献。
民族民俗学的调查和征集工作是南博机构建置的另一特点，是全国博物馆中唯一设置有民族民俗学研究的机构，它起源于40年代在川、康、黔等省对彝、纳西、苗、傣、傈僳等少数民族的调查，而近年主要对太湖地区汉族的民俗、民风进行专题调查，并取得了可喜的成果。
文物保护技术研究起步于70年代中、后期，近10年来就先后有“旧纸张保护技术”、“NMF—1防霉剂”、“复方中草药杀虫剂”等14个项目，相继获国家、文化部、省文化厅各种等级大奖或进步奖。其他科研项目亦取得可喜的成果，据不完全统计，先后发表各种论著800篇（本），其中《南唐二陵》、《沂南汉像石墓发掘报告》、《六朝艺术》、《南京博物院藏宝录》、《华夏瑰宝》、《东方文明之光——纪念良潜文化发现60周年》等科学性较高的专著在国内外具有重大影响。还有11篇论文获省社科二、三等奖，9篇论文获省文化厅首届科研成果一、二、三等奖。院办的《东南文化》杂志已连续三届被评为省内10种优秀社科杂志之一。近年还多次成功地举办了多种学术研讨会。其他方面诸如环境绿化、摄影、书法作品、治安保卫等，也都受到政府的嘉奖。
此外，省博物馆学会、考古学会、民俗学会和吴文化学会都挂靠在南京博物院，并组织开展了大量的学术活动。“国家文物出境鉴定江苏站”也附设在这里。还为南京大学、厦门大学、中山大学、复旦大学等10多所高校指导研究生、本科生，帮助实习辅导。又是南京地区大、中、小学生爱国主义教育基地。同时还受国家文物局委托，不定期培训文博专业人员。为全国各地的文博单位培养了若干专业人才。
目前全院有各类专业人员170余人，其中具有中高级职称的占50%以上，设有考古研究所、民族民俗研究所、古代艺术研究所、文物保护技术研究所、古建筑研究所、陈列展览部、保管部、文物征集部、图书馆、办公室、保卫部、服务部等职能部门，还设有《东南文化》杂志社，出版发行《南京博物院集刊》和《东南文化》两种杂志，具有配置成套的组织机构和一支政治素质和业务水平较高的专业队伍。正在组织实施《南京博物院“九五”规划和2010年远景发展设想》。
南京博物院正以前所未有的现代化、科学化、专业化管理与世界博物馆接轨，走向二十一世纪。
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